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層析工藝放大需要遵循的原則

 更新時(shí)間:2023-02-01 點(diǎn)擊量:1514
層析工藝放大原則包括線性放大原則和固定保留時(shí)間原則。

線性放大原則

線性放大原則是工藝放大過(guò)程中常用的原則,其核心思路是保持層析柱柱高和線性流速不變,只放大層析柱直徑和體積流速。固定的柱高和線性流速理論上可以保證相同的保留時(shí)間、層析中溶液用到的CV數(shù)和洗脫樣品CV數(shù),較大程度保證相同的純化效果。

線性放大原則的具體操作方法可參見(jiàn)下表:

層析工藝

在實(shí)際的應(yīng)用過(guò)程中,線性放大可能會(huì)遇到幾個(gè)問(wèn)題,一是層析設(shè)備供應(yīng)商提供的層析柱都是幾個(gè)固定規(guī)格,可能無(wú)法適配具體某項(xiàng)的工藝需求;二是當(dāng)層析柱直徑超過(guò)30cm時(shí),由于柱壁支撐效應(yīng)的降低,通常會(huì)造成層析填料的過(guò)度壓縮,從而導(dǎo)致反壓增大,小試規(guī)模優(yōu)化設(shè)計(jì)的線性流速則有可能無(wú)法實(shí)現(xiàn)。此時(shí),可以考慮固定保留時(shí)間原則。

固定保留時(shí)間原則

固定保留時(shí)間原則只要求保持層析工藝的保留時(shí)間不變,層析柱柱高和線性流速則可以同時(shí)改變。這樣層析柱的選擇就會(huì)更加靈活。一般的蛋白純化,如親和層析、疏水層析和離子交換層析的結(jié)合/洗脫模式,都有成功應(yīng)用固定保留時(shí)間原則進(jìn)行放大工藝的開(kāi)發(fā)的案例,這樣可以避免珍貴樣品、層析填料的浪費(fèi),有效降低生產(chǎn)成本。

當(dāng)然,固定保留時(shí)間原則也具有一定的局限性,對(duì)于一些對(duì)流擴(kuò)散主導(dǎo)的層析,也就是層析純化依賴于理論塔板數(shù)的層析方法,如凝膠過(guò)濾層析,層析線性流速對(duì)于分離效果具有顯著影響,則不適用于固定保留時(shí)間原則。多模式的層析通常也不適用固定保留時(shí)間原則。

層析工藝需要確認(rèn)的因素

層析系統(tǒng)

與小試所用的層析系統(tǒng)相比,商業(yè)化生產(chǎn)用層析系統(tǒng)需要考慮:

1.系統(tǒng)管路的死體積。大規(guī)模生產(chǎn)用層析系統(tǒng)往往具有較大的死體積,層析過(guò)程會(huì)造成樣品的擴(kuò)散,從而影響洗脫收集體積和分離分辨率。

2.紫外流通池長(zhǎng)度。紫外流通池的長(zhǎng)度變化會(huì)造成蛋白吸收峰高的變化,從而影響洗脫峰的起收點(diǎn)和停收點(diǎn)。

3.泵的設(shè)計(jì)。泵的設(shè)計(jì)會(huì)帶來(lái)不同的剪切力,對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性帶來(lái)影響。同時(shí),泵的精度還會(huì)影響緩沖液及樣品體積的控制。

4.混合效果。如果使用雙泵進(jìn)行線性洗脫,雙泵緩沖液的混合則會(huì)影響最終的洗脫效果。

層析柱

層析柱的選擇需要考慮的因素有:

1.層析柱的尺寸和材質(zhì)。層析柱的尺寸可以根據(jù)上文規(guī)模放大的幾項(xiàng)原則來(lái)確定。層析柱常用的材質(zhì)有玻璃、丙烯酸和不銹鋼,使用不同材質(zhì)的層析柱需要考慮其溶出物/浸出物,以及對(duì)層析填料清潔試劑的耐受性。

2.層析柱與層析系統(tǒng)和層析填料的匹配性

3.層析柱操作的難易程度。 隨著層析柱直徑的增加,層析柱的裝填也變困難。通常的解釋是隨著柱直徑的增加,填料的柱壁支撐效應(yīng)減少,造成反壓升高,柱床不穩(wěn)定性增加,從而影響分離效果。此外,采用可自動(dòng)化裝柱的層析柱,可有效增加層析柱放大的成功率。

層析填料

在小試規(guī)模的工藝開(kāi)發(fā)階段,通常會(huì)對(duì)層析填料的結(jié)合載量、配基脫落量等基礎(chǔ)性能進(jìn)行嚴(yán)格篩選,但是中試及生產(chǎn)規(guī)模的工藝往往會(huì)暴露層析填料一些容易被忽視的問(wèn)題。例如上文提及的柱壁支撐效應(yīng)減少,造成反壓升高的問(wèn)題,在小試階段就極難被發(fā)現(xiàn)。

非層析因素

在層析工藝的放大過(guò)程中,還需要考慮和確認(rèn)一些非層析因素:

上游培養(yǎng)來(lái)料

緩沖液的配制方法及儲(chǔ)存

中間品的處理及保存時(shí)間

操作溫度

  蘇州阿爾法生物提供層析系統(tǒng)填料包括 瓊脂糖凝膠過(guò)濾基質(zhì)填料、組氨酸標(biāo)簽蛋白分離層析親和蛋白純化介質(zhì)等用于蛋白純化、蛋白質(zhì)分離等。


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