DNA重組技術（連接）

一、實驗目的

    體外連接獲得重組分子，用于轉(zhuǎn)化受體細胞。

二、實驗原理

DNA重組技術是用內(nèi)切酶分別將載體和外源DNA切開，經(jīng)分離純化后，用連接酶將其連接，構成新的DNA分子。

外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應策略有以下幾種：

1、帶有非互補突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進行消化可以產(chǎn)生帶有非互補的粘性末端，這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下，常用質(zhì)粒載體均帶有多個不同限制酶的識別序列組成的多克隆位點，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴增時，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點以便與載體相連。

2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個相同粘性末端，因此在連接反應中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個分子串連形成寡聚物，而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細調(diào)整連接反應中兩種DNA的濃度，以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達到高的水平。還可將載體DNA的5'磷酸基團用堿性磷酸酯酶去掉，MAX大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。帶5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連，產(chǎn)生一個帶有兩個缺口的開環(huán)分子，在轉(zhuǎn)入E.coli受體菌后的擴增過程中缺口可自動修復。

3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應中，T₄ DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。

特殊情況下，外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配，則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配， 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端，使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進行連接。

三、 主要試劑

　  T₄ 連接酶、無菌水、質(zhì)粒和PCR的酶切產(chǎn)物。

四、儀器耗材

　  微量移液槍，Tip、eppendorf管、低溫水浴鍋。

五、 連接反應　　　

          質(zhì)粒酶切產(chǎn)物    1

          PCR酶切產(chǎn)物    4

          T₄ ligase         1

          10×bf           1

          H₂O            3

         -------------------------------

Total          10 μL

六、注意事項

1. 操作時，注意保持低溫狀態(tài)，因為Ligase酶很容易降解。

2. 連接反應，一般14-16℃，O/N. 

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