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瓊脂糖核酸電泳介紹

 更新時(shí)間:2023-11-21 點(diǎn)擊量:744

瓊脂糖核酸電泳步驟

1.    用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈, 放在制膠平板上, 封閉模具邊緣, 架好梳子;

2.    根據(jù)欲分離 DNA 片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠:準(zhǔn)確 稱量瓊脂糖干粉, 加入到配膠用的三角燒瓶?jī)?nèi), 定量加入電泳緩沖液(一般

20~30 ml);

3.    放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻, 加入一滴熒光染料,輕輕旋轉(zhuǎn)以充分

混勻凝膠溶液,倒入電泳槽中,待其凝固;

4.    室溫下 30~45 分鐘后凝膠全凝結(jié), 小心拔出梳子, 將凝膠安放在電泳槽內(nèi);

5.    向電泳槽中倒入電泳緩沖液,其量以沒過膠面 1mm 為宜,如樣品孔內(nèi)有氣

泡,應(yīng)設(shè)法除去;

6.    在 DNA 樣品中加入 10×體積的載樣緩沖液(loading buffer),混勻后,用槍

將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi);

7.    接通電源, 紅色為正極,黑色為負(fù)極, 切記 DNA 樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng) (靠

近加樣孔的一端為負(fù))。一般 60 ~ 100V 電壓,電泳 20 ~ 40min 即可;

8.    根據(jù)指示劑泳動(dòng)的位置,判斷是否終止電泳;

9.    電泳完畢, 關(guān)上電源, 在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置,并與核酸分子

量標(biāo)準(zhǔn) Marker 比較被擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。

瓊脂糖凝膠濃度與線形 DNA 的最佳分辨范圍

瓊脂糖凝膠濃度

線形 DNA 的最佳分辨范圍(bp

0.5%

1,000  30,000

0.7%

800  12,000

1.0%

500  10,000

1.2%

400  7,000

1.5%

200  3,000

2.0%

50  2,000

 

膠回收純化 DNA

1.   瓊脂糖電泳,將特異電泳帶用刀切下放入到 EP 管中,稱瓊脂糖帶的重量;

2.   按照每 100mg  400µl 的量加入binding buffer,放入到 EP 管振蕩器中,45 ~

55溫育振蕩,直到所有的瓊脂糖都溶解(大概要 5 分鐘 );

3.   取出純化柱, 將上述溶解液轉(zhuǎn)移至柱中, 室溫下放置 2 分鐘, 8,000rpm   離心

1 分鐘,棄 EP 管中的液體,將純化柱放回 EP 管中;

4.    500µl  wash buffer 至柱中, 8,000rpm   離心 1 分鐘。棄管中的溶液;

5.   重復(fù)操作 4 步的操作 1 次,最后將純化柱放入 EP 管中 10,000rpm  離心 30 秒,

除去痕量的 wash buffer;

6.   將純化柱放入一個(gè)新的 EP 管。加 30~40µl H2O 或者 elution buffer 至純化柱膜 的中央,在37 50下放置 2 分鐘, 10,000rpm 離心 1 分鐘洗脫 DNA,將

EP 管中的 DNA 溶液放在-20保存。

7.   注: 若想要不電泳而直接純化 DNA 溶液, 只需要在第 2 中按 100µl 液量加 400µl  binding buffer,其余的步驟不變。

 

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