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實時熒光定量PCR技術介紹

 更新時間:2024-08-09 點擊量:415

實時熒光定量PCR(qPCR)是一種在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程,最后通過標準曲線對初始模板進行定量分析的方法。該技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,它的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)PCR不能對初始模板定量分析的問題。熒光定量PCR具有準確性高、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點,目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域。

熒光定量PCR步驟

熒光定量PCR原理

PCR反應體系中加入熒光基團,隨著PCR反應的進行,PCR反應產物不斷累積,熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)收集一個熒光強度信號,通過熒光強度變化檢測產物量的變化,末了得到一條熒光擴增曲線圖,擴增曲線橫坐標表示循環(huán)數(shù),縱坐標表示熒光強度。


PCR熒光2


熒光定量PCR常用術語


  1. 基線:實時熒光定量PCR反應的基線是指在PCR的最初幾個循環(huán)中(一般為3-15個循環(huán))的信號水平。此階段的熒光信號變化量極小。

  2. 熒光閾值:熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值,它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上,一般熒光閾值默認是PCR 3-15個循環(huán)熒光信號標準偏差的10倍。

  3. Ct值:Ct值指的是PCR擴增過程中擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的循環(huán)數(shù)。

  4. 標準曲線:標準曲線是標準物質的物理/化學屬性跟儀器響應之間的函數(shù)關系。對已知拷貝數(shù)的標準樣品做系列稀釋,對不同稀釋度的標準樣品進行熒光定量PCR并記錄Ct值,根據Ct值及拷貝數(shù)的對數(shù)繪制得到標準曲線,標準曲線的縱坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),橫坐標代Ct值。

  5. 實現(xiàn)對初始模板的定量

  6. 利用實時熒光定量 PCR對樣品的初始模板量進行定量分析,需要利用已知起始拷貝數(shù)的標準品作出標準曲線,再通過熒光定量PCR獲得未知樣品的Ct值,最后從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

  7. 標準曲線繪制

  8. 標準品的制備:設計特定引物,利用PCR對目的基因片段進行擴增,隨后將目的基因片段克隆至載體中,測序驗證是否為陽性重組質粒,最后收集陽性克隆質粒作為標準品。

  9. 繪制標準曲線:測定質粒的濃度,依據公式計算出質粒的拷貝數(shù)。對質粒進行系列稀釋,分別作為模板進行熒光定量PCR并記錄Ct值。最后依據起始拷貝數(shù)的對數(shù)及Ct值繪制標準曲線,得到標準方程。當需要對起始模板進行定量時,只需要得到擴增曲線,讀得Ct值,帶入標準方程即可對起始模板定量。

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熒光標記方法

熒光定量PCR熒光標記方法可分為熒光染料法和熒光探針法兩類。


  • 熒光染料:染料法是利用熒光染料可以嵌合到DNA雙鏈內部的特性,來指示擴增產物的增加。

  • 熒光探針:探針為一段寡核苷酸,可與DNA序列特異性結合,一個模板結合一個探針。探針5’端具有報告基團(R),可發(fā)光;3’端有熒光淬滅基團(Q),能吸收光。探針完整時R基團所發(fā)射的熒光能量被Q基團吸收,PCR儀檢測不到熒光信號。隨著擴增的進行,探針會被聚合酶水解,報告基團發(fā)出的光沒有被淬滅基團吸收,從而被儀器檢測到。


熒光探針與染料法對比

探針法:特異性高、重復性好,但只適合一個特定的目標,探針價格較高。

染料法:對DNA模板沒有選擇性,適用于任何DNA,使用方便,成本低,但容易與非特異性雙鏈DNA結合,產生假陽性。


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熒光定量PCR應用

  實時熒光PCR技術已廣泛應用于醫(yī)學及生命科學研究的各個領域中。在科研方面可定量分析各種基因的表達分析,基因突變和多態(tài)性分析,單核苷酸多態(tài)SNP測定及易位基因的檢測;在醫(yī)學方面可用于免疫組化分析、早期篩查、病原體檢測、耐藥性分析、腫瘤微小殘留病變研究等。

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