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臺盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟和方法

 更新時間:2022-04-12 點(diǎn)擊量:9217

細(xì)胞計(jì)數(shù)是確定培養(yǎng)中鋪板的細(xì)胞濃度、確定細(xì)胞活力和評估細(xì)胞分離程序結(jié)果的一個組成部分。建議在細(xì)胞分離之前進(jìn)行初始細(xì)胞計(jì)數(shù);然后可以將該數(shù)字與細(xì)胞分離后的細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較,以計(jì)算細(xì)胞恢復(fù)率。此外,當(dāng)預(yù)期細(xì)胞活力可能會降低時,應(yīng)進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù),例如,在處理冷凍保存的細(xì)胞或離體操作的細(xì)胞時。


    可以使用臺盼藍(lán)3% 乙酸和亞甲藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行總有核細(xì)胞計(jì)數(shù)時,建議使用 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)。乙酸溶解細(xì)胞膜,亞甲藍(lán)染色暴露的細(xì)胞核。由于成熟的紅細(xì)胞缺乏細(xì)胞核,因此在計(jì)數(shù)時被排除在外?;蛘?,建議使用臺盼藍(lán)來計(jì)數(shù)活的哺乳動物細(xì)胞。臺盼藍(lán)穿透細(xì)胞膜,因此它進(jìn)入細(xì)胞膜受損的細(xì)胞(死細(xì)胞)的細(xì)胞質(zhì),將它們?nèi)境伤{(lán)色?;罴?xì)胞保持完整,可以通過排除藍(lán)色染料的能力與死細(xì)胞區(qū)分開來。在這種情況下,人們將計(jì)算完整的活細(xì)胞。

   本文描述了如何使用 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)進(jìn)行總有核細(xì)胞計(jì)數(shù),以及如何通過臺盼藍(lán)染料排除進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

 

 

材料準(zhǔn)備:

 

3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)(或臺盼藍(lán)

96 孔板(例如 Corning® 96 孔圓底微孔板,貨號 #38018)或微量離心管(例如 Costar® 微量離心管,貨號#38090

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(血細(xì)胞計(jì)數(shù))和蓋玻片

70% C2H6O

移液器(例如瑞寧移液器)

 

實(shí)驗(yàn)步驟和方法:

 

第一部分:樣品制備

 

選項(xiàng) 1:用 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)對總有核細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞稀釋

  使用磷酸鹽緩沖鹽水或無血清培養(yǎng)基對充分混合的單細(xì)胞懸浮液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。為了準(zhǔn)確表示濃度,請使用至少 20 μL 的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行稀釋。

示例:制備 10 倍稀釋液

在微量離心管或 96 孔板的孔中加入 180 μL 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)。混合細(xì)胞懸浮液,將 20 μL 添加到含有 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán)的試管或孔中。

 

選項(xiàng) 2:通過臺盼藍(lán)染料排除對活細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞稀釋

 

 確保要計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液*重新懸浮。在細(xì)胞沉降之前,將適量的細(xì)胞懸液 (20-200 μL) 放入離心管中。加入等體積的 0.4% 臺盼藍(lán)并輕輕混合。將混合物在室溫 (15°C – 25°C) 下孵育 5 分鐘。

 

第二部分:使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

 

   通過用 70% C2H6O清潔腔室表面來制備血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。擦干。將蓋玻片放在腔室上。

 使用 20 μL 移液器重新懸浮細(xì)胞混合物,并將 10 μL 的染色細(xì)胞放入血細(xì)胞計(jì)室。

注意:小心不要移動蓋玻片。允許毛細(xì)作用將樣品吸入。

 

 將血細(xì)胞計(jì)數(shù)器放在雙目光學(xué)顯微鏡的載物臺上。將顯微鏡調(diào)整到 10 倍放大倍率并聚焦在細(xì)胞上。

 使用手動計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)器,計(jì)算血細(xì)胞計(jì)數(shù)器四個外部正方形中的每一個中的細(xì)胞(染色的細(xì)胞核)(圖 1A),包括位于底部和左側(cè)周邊的細(xì)胞,但不包括位于頂部和右手邊(圖 1B)。如果在第一部分中使用了 3% 乙酸和亞-CH3藍(lán),則計(jì)算染色的細(xì)胞核。如果在第一部分中使用了臺盼藍(lán),則計(jì)算未染色的活細(xì)胞。

細(xì)胞計(jì)數(shù)儀.jpg 

 

1.血細(xì)胞計(jì)數(shù)器網(wǎng)格線

 

血細(xì)胞計(jì)數(shù)器圖指示(A)四組紅色和(B)其中一組應(yīng)用于計(jì)數(shù)的 16 個方塊。

 

注意: 適當(dāng)?shù)南♂屜禂?shù)將取決于起始樣本中存在的大致細(xì)胞數(shù)量,但應(yīng)使血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中的細(xì)胞濃度為每平方(即大或主要正方形)50-100 個細(xì)胞。如果血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上每個主要正方形的細(xì)胞多于或少于大約 100 個,請使用更大或更小的稀釋因子制備新的稀釋樣品。

 

     血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的九個主要方塊中的每一個都代表 0.1 mm 3的總體積。由于 1 cm 3相當(dāng)于 1 mL,因此可以使用以下等式確定細(xì)胞濃度:

有核細(xì)胞總數(shù)/mL = 每平方平均細(xì)胞數(shù) x 稀釋因子 x 10 4

示例:如果四個外部方塊中的每一個的細(xì)胞計(jì)數(shù)在 100 稀釋因子下分別為 21、1520 17,則平均細(xì)胞計(jì)數(shù)將為 (21 + 15 + 20 + 17) ÷ 4 = 18.25。

因此,原始懸浮液中細(xì)胞的總濃度為:18.25 x 100 x 10^4 = 18,250,000 個細(xì)胞/mL。

 

使用人工的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法誤差率較高,為提高細(xì)胞計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和細(xì)胞計(jì)數(shù)效率可以使用全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。博大博聚旗下的全自動細(xì)胞細(xì)胞計(jì)數(shù)儀系列,具有多種規(guī)格供選擇,可以滿足不同的用戶需求。


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